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| 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,化工,生物產(chǎn)業(yè),制藥 |
間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基
MSC BeautiStemTM XF Medium
一、目的：利用間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。二、材料：新生兒臍帶
三、主要儀器：醫(yī)用手術(shù)器械，生物安全柜，CO2 培養(yǎng)箱，6 孔培養(yǎng)板，T25 培養(yǎng)瓶
四、試劑：
表 1 MSC BeautiStemTM XF Medium
品牌 | 貨號(hào) | 名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
NANOLAB | NA500 | MSC BeautiStemTM XF Basal Medium MSC 無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基 | 500ml | 4℃ |
NANOLAB | NAS03 | MSC BeautiStemTM XF Supplement MSC 無血清添加劑 | 3ml | -20℃ |
NANOLAB | NAA01 | MSC Attachment solution (100X) MSC 貼壁試劑 | 1 ml | 4℃ |
NANOLAB | P0500LT | Human Platelet Lysate 血小板裂解物 | 500ml | -20℃ |
表 2 建議選用試劑
NANOLAB | NA079-100ML | Recombinant Trypsin-EDTA Solution 重組胰酶-EDTA | 100ml | RT |
NANOLAB | NA048-20ML | Soybean Trypsin Inhibitor (50X) 大豆胰酶抑制劑 | 20 ml | -20℃ |
NANOLAB | NA712-10ML | MSC Freezing Solution MSC 凍存液 | 10 ml | 4℃ |
NANOLAB | NA023-500ML | DPBS (w/o Ca & Mg) DPBS 緩沖液 | 500 ml | RT |
NANOLAB | NA031-100ML | Penicillin-Streptomycin Solution(100X)青鏈雙抗 | 100ml | -20℃ |
NANOLAB | NA35010100 | MSC ACF Tissue Digestive Mix ACF 高效原代間充質(zhì)干細(xì)胞分離液 | 100ml | -20℃ |
五，實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
5.1 *培養(yǎng)基的準(zhǔn)備
5.1.1 凍存的 MSC BeautiStemTM XF Supplement 在室溫或 2-8℃解凍，避免反復(fù)凍融。
5.1.2 配制：MSC BeautiStemTM XF Basal Medium（培養(yǎng)基）：MSC BeautiStemTM XF
Supplement（添加物）：青鏈雙抗=500ml：3ml：5ml，4℃保存，2 周內(nèi)使用。
注 1：雙抗非必須，建議原代（P0）時(shí)使用。
注 2：培養(yǎng)基含 L-Glutamine，貯藏時(shí)避免長(zhǎng)期照光。
5.2 包被培養(yǎng)皿
或跳過此步驟，直接加 2%血小板裂解物（P0500LT），促進(jìn) MSC 細(xì)胞貼壁與生長(zhǎng)。
5.2.1 使用 DPBS 溶液（貨號(hào)：NA023-500ML），將 MSC 貼壁試劑稀釋 100 倍（1:100）。
5.2.2 參照表 3，加入適量的 1XMSC 貼壁試劑涂層培養(yǎng)皿或板。
表 3 涂層過程中貼壁試劑建議使用量
培養(yǎng)器皿 | 表面積 cm2/孔或瓶 | 1X MSC 貼壁試劑使用體積 |
96 孔板 | 0.34 | 0.05~0.1 ml |
24 孔板 | 1.9 | 0.2~0.4 ml |
12 孔板 | 3.9 | 0.4~0.8 ml |
6 孔板/ 35 cm 培養(yǎng)皿 | 9.6 | 1~2 ml |
T25 瓶/ 60 cm 培養(yǎng)皿 | 25 | 2.5~5 ml |
T75 瓶 | 75 | 7.5~15 ml |
注 1：涂層的培養(yǎng)皿需在無菌條件下 2℃-8℃儲(chǔ)存，需在一周內(nèi)使用。（標(biāo)示紅色為原廠建議使用量，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)測(cè)試后可減半使用）
注 2：包被期間， 注意包被液不可以干掉！
注 3：若使用預(yù)包被培養(yǎng)瓶（Corning 的 CellBind，貨號(hào)：3289/3290 等）, 步驟 5.2 的包被可略過。
5.2.3 輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，確認(rèn)貼壁試劑均勻分布在培養(yǎng)皿表面后，用封口膜包裹涂層的培養(yǎng)皿。
5.2.4 在 2-8℃孵育過夜；或者在 CO2 培養(yǎng)箱，37℃，至少孵育 30 分鐘。
5.2.5 接種前, 吸除貼壁試劑，再用 DPBS 輕輕沖洗培養(yǎng)皿，即可接種細(xì)胞。
5.3 制備 1X 大豆胰酶抑制劑
5.3.1 使用無菌的 DPBS，將 50X 大豆胰酶抑制劑（NA048-20ML）稀釋成 1X。
六、使用范例：
6.1 UC-MSC 原代培養(yǎng) （組織塊法）
6.1.1 無菌條件下取新鮮臍帶，用 DPBS 漂洗凈血跡
* 一般臍帶取得非無菌環(huán)境，可以稍微用 75%酒精潤(rùn)洗。
6.1.2 置 10cm 培養(yǎng)皿中，剪成 1~2cm 臍段，剔除血管，用 DPBS 洗凈血跡，再剪成 1mm3
組織塊。(圖 1)
6.1.3 用無菌滴管吸取少量細(xì)小組織塊均勻散布在 6 孔板 2 個(gè)孔中。
6.1.4 37℃，5%CO2 培養(yǎng)箱孵育 30min，以使組織塊粘貼在培養(yǎng)皿壁上。
6.1.5 向每孔滴加 0.8ml *培養(yǎng)基 (注意沿孔壁小心滴加，勿使沖動(dòng)組織塊)。
6.1.6 37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱孵育過夜，次日 (D1) 每孔再補(bǔ)加 1ml *培養(yǎng)基。
6.1.7 37℃，5% CO2 繼續(xù)培養(yǎng)，5 天 (D6) 后半量換液 (此時(shí)一般看不到細(xì)胞，但快 3
天就可看到細(xì)胞從組織邊沿爬出)。
6.1.8 再過 5 天后半量換液 (此時(shí)一般會(huì)有細(xì)胞爬出，但晚可到 14 天會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞從組織邊沿爬出) (圖 2、圖 3)。
6.1.9 每 2 天換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng) 2~4 天，待細(xì)胞融合度（Confluency）達(dá)到約 80%
后傳代培養(yǎng)(圖 4)。
注 1：組織塊培養(yǎng)的關(guān)鍵是要保障組織塊始終貼壁，換液動(dòng)作要盡可能輕微，避免沖動(dòng)組織塊。培養(yǎng)基加量不能太多，以免組織塊漂浮。
注 2：為增加成功率，從原代分離臍帶和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞, 培養(yǎng)基可加 2.5%的人 AB 血清(人 AB 型血清必須除菌過濾，且 HbsAG 及 HCV/HIV 抗體陰性)。
6.2 UC-MSC 原代培養(yǎng) （消化法）
MSC BeautiStemTM XF Medium 也能有效地培養(yǎng)消化法取得的原代細(xì)胞，操做方式可依各實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)步驟，或參考上海中韜 MSC ACF Tissue Digestive Mix (貨號(hào)：C35010010) 的使用說明。
6.2.1 將臍帶用 DPBS 漂洗干凈，剪成 1-2cm,后剔除血管。
* 一般臍帶取得非無菌環(huán)境，可以稍微用 75%酒精潤(rùn)洗。
6.2.2 將組織剪成 3-5mm3 后，移入 50ml 離心管，再加入的分離液。
* 一條長(zhǎng)度 10 公分的臍帶建議加入 10ml 的分離液；或者組織塊 : 分離液（vol）= 1:1。
** 視情況而定，可自行在分離液中添加 1%青鏈雙抗(BI, Cat# 03-031-1B) 。
6.2.3 把 50ml 離心管橫放在 37 度細(xì)胞培養(yǎng)箱，過夜反應(yīng)（16 小時(shí)）。
* 若總反應(yīng)體積較大，也可持續(xù)旋轉(zhuǎn)混合。
6.2.4 加入和分離液等體積的 0.05%EDTA（NANOLAB, Cat#NA015-100ML）終止反應(yīng)后，1500 xg 離心5 分鐘，去除上清。
* 溶液比較濃稠，小心不要影響下層的細(xì)胞;建議留下 5ml 左右的溶液。
** 若是脂肪組織，沒有粘稠的情形，以常規(guī)的 200-300 xg 離心即可。
*** 沒有 EDTA, 可使用無鈣鎂 DPBS 取代；此時(shí)建議后面步驟 6 多重復(fù) 2-3 次，以確實(shí)去除酵素。
6.2.5 以和分離液等體積的無鈣鎂 DPBS 重懸細(xì)胞后，500 xg 離心 5 分鐘，去除上清。
6.2.6 再次以和分離液等體積的無鈣鎂 DPBS 重懸細(xì)胞后，250 xg 離心 5 分鐘，去除上清。
6.2.7 用適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，即可按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法接種 P0 代細(xì)胞培養(yǎng)。
* 消化后的原代細(xì)胞，建議培養(yǎng)時(shí)接種密度提高到 10,000/cm2 以上；傳代后即可按常規(guī)的接種密度培養(yǎng)。
6.3 UC-MSC 傳代培養(yǎng)與凍存
6.3.1 待細(xì)胞融和度達(dá)到約 80%后進(jìn)行傳代（細(xì)胞不能太密集，否則容易分化），吸棄傳代板孔中的培養(yǎng)基，每孔加適量 DPBS 輕輕沖洗 1 次。
6.3.2 根據(jù)培養(yǎng)皿適量加入重組胰酶-EDTA（貨號(hào)：NA079-100ML，T25 建議使用 1ml），在 37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱作用 3~5 min（可輕拍培養(yǎng)瓶幫助細(xì)胞脫落）。
6.3.3 顯微鏡下觀察細(xì)胞*脫落后, 根據(jù)重組胰酶-EDTA 使用量加入10 倍體積的大豆胰
酶抑制劑（1X），1000rpm 離心 3~5min。例：用 1ml 重組胰酶-EDTA，則加入 1ml
大豆胰酶抑制劑（1X）與細(xì)胞混和均勻，再離心。
6.3.4謹(jǐn)慎吸出上清，細(xì)胞團(tuán)塊用適當(dāng)體積的*培養(yǎng)基懸浮后，混勻細(xì)胞懸液。
6.3.5 按照所需的比例進(jìn)行傳代或按照 5000-6000cells/cm2 的細(xì)胞密度將細(xì)胞接種至培養(yǎng)器皿中，放入 37℃, 5% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
6.3.6每 2-3 天更換一次培養(yǎng)基， 待細(xì)胞融合度達(dá)到 80% 左右時(shí)，參照操作步驟
6.3.1~6.3.5 做細(xì)胞傳代;或者參照操作步驟 6.3.1~6.3.3 收獲細(xì)胞凍存。
6.3.7 細(xì)胞凍存：將細(xì)胞團(tuán)塊懸浮于適量 (0.5~1×106cells/ml) MSC 凍存液（貨號(hào)： NA712-10ML）中，裝入凍存管，2~8℃冰箱放置 30min，-80℃冰箱放置 24h，轉(zhuǎn)入液氮罐凍存。
注：本方法僅供參考，用戶可根據(jù)自身經(jīng)驗(yàn)做合理調(diào)整。附圖：（如下是組織塊法，建議客戶可以嘗試消化法）
